BCA蛋白定量和Bradford法蛋白定量有哪些區別

時間 2021-05-04 09:19:05

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一、原理不同

bca蛋白定量:鹼性條件下,蛋白將cu2+還原為cu+, cu+與bca試劑形成紫顏色的絡合物,吸光強度與蛋白濃度成正比。測定其在562nm處的吸收值,並與標準曲線對比,即可計算待測蛋白的濃度。

bradford法蛋白定量:在一定的濃度範圍內,蛋白質-染料複合物在波長為595nm處的光吸收與蛋白質含量成正比,通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。

二、樣品中物質含量不同

bca蛋白定量:樣品中高達5%的sds,5%的triton x-100,5%的tween 20、60、80。

bradford法蛋白定量:樣品中sds低於0.01%,triton x-100低於0.05%,tween 20、60、80低於0.015%。

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bca蛋白定量的注意事項:

1、bca蛋白定量時,吸光度可隨時間的延長不斷加深,且顯色反應會隨溫度公升高而加快,故如果濃度較低,適合較高溫度孵育or延長孵育時間。

2、標準蛋白液的加量應當準確,如果加量不準確,會導致製作出來的標準曲線出現偏差,影響待測樣品的濃度計算,所以一方面需要用梯度稀釋的方法來配置標準蛋白液,另一方面應使用精確度高的移液槍。

3、為加快bca蛋白定量測定蛋白濃度的速度可以適當用微波爐加熱,但切勿過熱。

4、當結果出現空白組本身就有較高的背景,可用bradford法蛋白定量重新測定蛋白濃度。

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1、bradford法測得的主要是鹼性氨基酸和芳香族氨基酸,bca則沒有選擇性

2、bca法蛋白濃度定量是二價銅離子在鹼性的條件下,可以被蛋白質還原成一價銅離子(biuret reaction),一價銅離子和獨特的bca solution a(含有bca)相互作用產生敏感的顏色反應。兩分子的bca螯合乙個銅離子,形成紫色的反應複合物。該水溶性的複合物在562nm處顯示強烈的吸光性,吸光度和蛋白濃度在廣泛範圍內有良好的線性關係,因此根據吸光值可以推算出蛋白濃度。

bradford法蛋白定量是染料與蛋白質結合後引起染料最大吸收的改變,從465nm變為595nm,光吸收增加。蛋白質染料複合物具有高的消光係數,因此大大提高了蛋白質測定的靈敏度,最低檢出量為1μg蛋白。染料與蛋白質的結合是很迅速的過程,大約需2min,結合物的顏色在1h內是穩定的。

一些陽離子,如k+,na+,mg2+,(nh 4 ) 2 so 4,乙醇等物質不干擾測定,而大量的去汙劑如tritonx100,sds等嚴重干擾測定,少量的去汙劑可通過用適當的對照而消除。由於染色法簡單迅速,干擾物質少,靈敏度高,現已廣泛應用於蛋白質含量的測定。

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